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XXVI Reunião Anual sobre Evolução, Sistemática e Ecologia Micromoleculares
Instituto de Química, Universidade Federal Fluminense, 1 a  3 de dezembro de 2004

Introdução

    Liquens, organismos simbióticos compostos por um fungo e uma ou mais algas formando uma íntima união biológica, são encontrados nos mais variados habitats, inclusive naqueles onde as condições para a vida são extremas.
    Dado à constância de composição química e ao fato de que a diferenciação morfológica nem sempre é fácil, as análises químicas de liquens para fins taxonômicos são muito empregadas. A determinação quimiotaxonômica desses organismos é comumente realizada por reações de coloração no talo, microcristalização, análises cromatográfica, por fluorescência e por espectrometria de massas¹. Alguns trabalhos empregando a RMN de ¹³C de polissacarídeos de liquens também tem mostrado a possibilidade de correlação entre espécimes de uma mesma família², no entanto, trata-se de uma técnica trabalhosa pois envolve a análise de espectros com alto grau de semelhança entre si.
    A RMN aliada à quimiometria já vem sendo usada para a caracterização de plantas³. Dado ao grande número de informações contidas no espectro de RMN de ¹H de uma amostra, a quimiometria tem se mostrado uma ferramenta valiosa, demonstrando como essa pode ser usada, como uma primeira avaliação, para determinar e caracterizar plantas, permitindo reconhecer as similaridades e diferenças na composição das amostras.
    No presente trabalho, duas análises de RMN de liquens foram efetuadas. Em uma, a partir de espectros de RMN HR-MAS, foram estudadas amostras do material vegetal intacto; na outra, após efetuada a extração dos metabólitos secundários, o extrato foi analisado por RMN de líquidos.
    A partir dos espectros de RMN de ¹H, foram realizadas as análises quimiométricas a fim de correlacionar os espécimes, gêneros e famílias, propondo o emprego destes para a quimiotaxonomia dos liquens.
 
 

Material e Métodos

    Espectros de RMN de ¹H de onze amostras de liquens pertencentes às famílias Phisciaceae e Parmeliaceae, previamente indentificadas, foram analisadas em triplicata.
    Na análise líquida (RMN de Líquidos), após a extração em acetona sob aquecimento brando e evaporação do solvente, o extrato foi solubilizado em DMSO-d₆ e analisado por RMN.
    Na análise semi-sólida (RMN HR-MAS) as amostras, previamente moídas em moinho criogênico, foram analisadas diretamente por RMN e uma sonda de HR-MAS.
    Após a obtenção dos espectros, o tratamento dos dados foi efetuado no programa Pirouette.
 
 

Discussão

    Os espectros de RMN de ¹H dos extratos (ánálise liquida) apresentaram sinais característicos de seus metabólitos secundários majoritarios. Através de Análise de Componentes Principais (PCA) e Análise Hierárquica de Clusters (HCA), foi possível discriminar os liquens quando aos seus gêneros e espécimes (Figura 1), onde os espécimes referentes a um mesmo gênero foram agrupados (retângulo tracejado) e discriminados dos demais gêneros estudados. No entanto, na análise líquda não foi possível a caracterização das famílias dos liquens.

    Na análise semi-sólida, os espectros de RMN HR-MAS de ¹H, apresentaram sinais característicos de polissacarídeos de liquens. Com a aplicação de métodos quimiométricos, observou-se uma satisfatória discriminação entre as amostras sendo possível agora a caracterização dos liquens a níveis de famílias, gêneros e espécimes. A Figura 2 ilustra a discriminação entre as famílias Phisciaceae (em vermelho) e Parmeliaceae (em azul). Apenas uma amostra apresentou comportamento anômalo (em verde).

    A discriminação entre os três gêneros estudados da família Phisciaceae também foi observada (Figura 3). Além disso, na análise de seis espécimes do gênero Parmotrema, pertencente à família Parmeliaceae, observou-se que por meio de PCA dos respectivos espectros de RMN HR-MAS de ¹H, foi possível a sua discriminação.

Conclusões

    A RMN aliada a quimiometria tem se mostrado uma ferramenta útil na determinação quimiotaxonômica de liquens. Por meio de RMN de líquidos, pode-se efetuar a caracterização de gêneros e espécimes. Por RMN HR-MAS, uma técnica que permite a análise direta de materiais semi-sólidos e ainda dispensa qualquer tipo de pré-tratamento de amostra, a discriminação foi mais eficiente, separando as famílias, gêneros e espécimes diferentes.
 
 

Referências bibliográficas

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¹ Honda, N. K. Vilegas, W. Quím. Nova 1998, 21(6), 110.
² Yokota, I. et al. Carbohyd. Res. 1979, 96, 252.
³ Ward, J. L. et al. Phytochem. 2003, 62, 949.

English

XXVI Reunião Anual sobre Evolução, Sistemática e Ecologia Micromoleculares
Instituto de Química, Universidade Federal Fluminense, 1 a  3 de dezembro de 2004

Introduction

    Lichens, symbiotic organisms that compose of a funus and one or more algae in tight biological union, are encountered in the most different habitats, including habitats with extreme life conditions.
    Chemical analyses of lichens in taxonomy are frequently used due to the constant chemical constitution of lichens and the fact that the lichen morphological differentiation is not always easy. Chemotaxonomic determination of these organisms is commonly realized by means of stalk coloration, microcrystallization, chromatographic analysis, fluorescence analysis and mass spectrometry¹. Some articles have shown that the ¹³C NMR of polysaccharides of lichens can be used for finding relationships between species of the same family². Hence, this is a laborious technique because it involves the analysis of spectra with high similarity.
    NMR coupled with chemometrics has been already used in plant characterization³. Due to the existence of vast amount of data contained in ¹H NMR spectra, chemometrics has shown to be useful methodology as for example, in determination and characterization of plants with recognition of similarities and differences that exist among the samples.
    In the present work, two NMR analyses of lichens were carried out. In one, based on NMR HR-MAS spectra, the samples of intact vegetal material were studied; in another, after the extraction of seconcary metabolites, the extract was analyzed by means of liquid NMR.
    Using the ¹H NMR spectra,  the chemometric analyses were performed in order to find the relationships between the species, genii and families, and to recommend the use of these methodologies in chemotaxonomy of lichens.
 
 

Materials and Methods

    The ¹H  NMR spectra of eleven lichen samples from the families Phisciaceae e Parmeliaceae, previously not identified, were analyzed in triplicates.
    In the liquid analysis (NMR of liquids), after extraction in acetone under mild heating and evaporation of the solvent, the extract was dissolved in DMSO-d₆ and analyzed by NMR.
    In the semi-solid analysis (HR-MAS NMR), the samples, previosly ground in criogenic mill, were analyzed directly by NMR and a HR-MAS probe.
    After recording the spectra, the data were analyzed by using program Pirouette.
 
 

Discussion

    The ¹H NMR spectra of the extracts (liquid analysis) had characteristic signals of the main secondary metabolites. Using Principal Component Analysis (PCA) and Hierarchical Cluster Analysis (HCA), it was possible to discriminate the lichens in terms of their genii and species (Figure 1). The species of the same genus were grouped (dashed rectangle) and differentiated from the other genii. However, it was not possible to characterize the lichen families in the liquid analysis.

    In the semi-solid analysis of ¹H spectra from HR-MAS NMR, characteristic signals of polysaccharides were observed. By applying chemometric methods, a good differentiation of the samples was obtained in terms of lichen families, genii and species. Figure 2 illustrates the discrimination of the families Phisciaceae (red) and Parmeliaceae (blue). Only one sample was anomalous (green).

    Discrimination of three genii of the studied family Phisciaceae was also observed (Figure 3). Besides, this discrimination was noticed also in the PCA of respective ¹H spectra from HR-MAS NMR.

Conclusions

    NMR coupled with chemometrics showed to be useful tool in chemotaxonomic determination of lichens. By means of NMR of liquids, it is possible to characterize genii and species. When using HR-MAS NMR, a technique that permits direct analysis of semi-solid materials and avoids any pre-treatment of samples, the discrimination was more efficient (separation of different families, genii and species).
 
 

References

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¹ Honda, N. K. Vilegas, W. Quím. Nova 1998, 21(6), 110.
² Yokota, I. et al. Carbohyd. Res. 1979, 96, 252.
³ Ward, J. L. et al. Phytochem. 2003, 62, 949.